Aktuality

Návštěva Národní referenční laboratoře pro lymskou boreliózu Státního zdravotního ústavu v Praze

V parném letním úterku jsme navštívili Národní referenční laboratoř pro lymskou boreliózu. Toto pracoviště zřízené Ministerstvem zdravotnictví provádí vědecký výzkum, zabývá se sběrem, kultivací a studiem borelií z klíšťat na území ČR, vyvíjí serologické testy s využitím kmenů izolovaných z pacientů, provádí přímou detekci borelií z biologických materiálů, vytváří standardy a hodnotí činnost dalších laboratoří, spolupracuje s lékaři na diagnostice. Je také v kontaktu s obdobnými zahraničními organizacemi.

Vedoucí laboratoře RNDr. Hulínská nás přivítala krátkou exkurzí po pracovišti, kde nám ukázala vybavení pro sérologické a molekulární vyšetřování vzorků pacientů a představila své spolupracovníky. Elektronový transmisní mikroskop ve vedlejší budově jsme zahlédli těsně po našem příchodu, právě dokončovala pozorování vzorků.

Jedno z prvních témat, na které přišla řeč, byla svízelná situace ve zdravotnictví a výzkumu. Ministerstvo snižuje financování státním ústavům rok od roku, naposled o cca 20%. Přestože dané pracoviště (NRL pro LB) přináší značné peníze do rozpočtu ústavu a provádí ročně několik tisíc vysoce odborných vyšetření, v rámci ústavu se finance přerozdělí a jdou třeba na opravy záchodů v jiné budově atd. Bohužel zde není žádná možnost, jak zajistit aby například peníze od samoplátců zůstaly přímo na provoz konkrétně této laboratoře.

Situace je tristní i z personálního hlediska, mladí laboranti /tedy spíše laborantky/ odcházejí na lépe financovaná pracoviště ve velkých pražských nemocnicích a ona musí vyvinout velké úsilí, aby tým udržela funkční. Nadšenci typu p. Votýpky jsou už dnes bohužel na vymření – mladí, vysokoškolsky vzdělaní pracovníci po zaučení odejdou za vyšším platem a kariérou. Za odchody na mateřskou nedostane laboratoř náhradu, taktéž hrozí, že za odešlé do důchodu nemusí přijít náhrada. V současné době fungují v pěti lidech...

Dr. Hulínská je velmi dobře obeznámená se situací v USA (ILADS vs. IDSA), nějakou dobu tam působila, mnoho zúčastněných (např. dr. Burrascana a další) zná osobně. Sama se setkala u studie o perzistentní infekci mozku a cystických formách borelií, na které v USA pracovala s tlakem shora, aby práce nebyla publikována a citována. Pravděpodobně přímo z CDC (Centrum pro kontrolu nemocí). Jedná se o ožehavé téma, ale z hovoru bylo patrné, že důvodem jsou finance jak pojišťoven, tak i přímo veřejného rozpočtu USA. Vzhledem k systému zdravotního (ne)pojištění v USA není v zájmu úřadů, aby byla borelióza uznána za závažné, životu nebezpečné onemocnění. Nepochybně by výzkum mohl jít značně rychleji kupředu, ale momentálně není zájem financovat a zveřejňovat informace, které by mohly vést k nabourání stávajících mýtů o neškodnosti borelií. Na druhou stranu je přesvědčená, že až hysterie některých amerických aktivistů věci příliš neprospívá. Osobně nevěří kospirativním teoriím, tvrdí že borelie jsou u nás od pravěku (viz informace o ještěrkách a plazech dále). Další věcí je to, že borelioza není pohlavně přenosná (o tom je Dr. Hulínská pevně přesvědčená), takže je na okraji zájmu infektologů a zdánlivě pro společnost nepředstavuje takové riziko, jako jiné nemoci.

Postupně se rozvinula diskuse na odborná témata co se týče diagnostiky. Měli jsme možnost letmo zahlédnout jak podrobnou dokumentaci a poznámky pro vlastní potřeby si uchovávají pro daného pacienta (pozn. přes stůl a vzhůru nohama, žádné osobní údaje). Jsou tam nalepené fotky z elektronové mikroskopie, tabulky z PCR, poznámkami a nákresy rukou se to jen hemžilo. Pro správné vyhodnocení zaslaného materiálu je velmi cenné, když na přímo na žádanku doktor napíše i krátkou anamnézu pacienta. Zatím to dělá jen KICH v Brně Bohunicích např. "pacient hospitalizován s horečkou a rozsáhlým EM", nebo "pacient v minulosti přeléčen pro neuroboreliozu,návrat příznaků" atd. Pomůže jim to lépe zaměřit spektrum vyšetření, protože jinak se dá vyšetřit čestvá nákaza LB, jinak u relapsu či reinfekce, popřípadě když je dle anamnézy podezření na koinfekci, mohou ji také došetřit.

Na koinfekce jsme se samozřejmě ptali, ehrlichioza skutečně není tak vzácné onemocnění, momentálně letos evidují 15 pozitivních vzorků od pacientů z ČR, některé jako souběžnou nákazu borelioza+ehrlichioza. Po vytažení klíštěte bývá klasický ohraničený EM větší než 5 cm, ale od středu nebledne, mohou v něm být oranžové pustulky. Příznaky typické pro ehrlichiozu jsou: horečky brzy po nakažení, žaludeční nevolnost, zvracení, zvýšené jaterní testy. Ehrlichiozu je nutné léčit tetracyklinovými atb, kapačky ani makrolidy na ni nezaberou.
Babesioza – dva případy z jižní Moravy, vzácná, ale na vyžádání (předpokládá se lékaře) ji bez problémů vyšetří. Bartonelu vyšetřují také, henselae není tak výjimečná („kočičí“), nedávný průzkum u bezdomovců odhalil B. quintana („zákopová horečka“).
Došla řeč na publikaci G. Staneka (Pandořina skříňka). Jeho údaje o padesátiprocentní promořenosti rakouských klíšťat babesiozou nepovažuje za zcela objektivní – lokality pro sběr byly prý nebyly vybrány náhodně, ale klíšťata byla sbírána cíleně na pastvinách, kde se pasou krávy. Babesia divergens je častý patogen hovězího dobytka.

Konkrétní poznatky:

1. virulenci daného kmene
2. množství borelií v klíštěti
3. zdravotním stavu nakaženého, imunitním systému a stávajích chorobách jako je např. porucha štítné žlázy nebo cukrovka aj. (cukrovkáři - velké riziko!)

Virulence
je daná antigenní výbavou daného kmene.
Každý druh - tj. B. afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto se ještě dělí na další podtypy a ty se můžou hodně lišit povrchovými antigeny, např. jen B. garinii má 7 kmenů. Ty "správné" antigeny na povrchu borelií jim umožní pronikat do hostitelských buněk, zejména do leukocytů, pomocí nich se pak už dostanou do celého těla (používají je jako dopravní prostředek).

Nákaza probíhá asi takto:
Borelie, které se dostanou z klíštěte do svrchní vrstvy kůže, nedokážou samy proniknout dál, přestože jsou to šikovné "vývrtky", kůže je opravdu dobrá izolační vrstva. Neprovrtají se skrz bazální membránu pod svrchní epitelovou vrstvou. Ty méně virulentní borelie vytvoří tedy jen lokální zánět a po čase chcípnou (možná nějaká ta cysta zůstane...?) Tím se vysvětluje ta často citovaná "samoúzdravnost" už ve fázi erythema migrans - lidé nakažení těmito "chabými" kmeny borelií můžou mít výstavní EM, ale nikdy neonemocní. Ty "ostřílenější" borelie vniknou dovnitř Langerhansových buněk v kůži (druh bílých krvinek) a těmi už se dostanou dál, přesně jak je popsáno v tomto článku: http://www.eucerin.cz/skin/immunesystem_of_the_skin.asp Jakmile se L. buňka dostane do kontaktu s patogenem, opouští kůži a putuje do nejbližší lymfatické uzliny... a nese si v sobě živé borelie. Tam si udělají přestupní stanici a dále cestují lymfou, dostanou se do krve a pak i do celého těla. Otok lymfatické uzliny poblíž místa přisátí klíštěte je tedy jasný příznak šíření infekce. Borelie také mohou postupovat od nervových zakončení v kůži podél nervových vláken do mozku, a tak krevní šíření obejít.

Intracelulární borelie
se nerozmnožují, uvnitř hostitelských buněk přežívají zřejmě v cystách. Po lýze buňky a uvolnění cyst do mezibuněčného prostoru, jestliže jsou okolní podmínky příznivé, se znovu rozvinou v aktivní spirochety, pokud ne, počkají si...

Spirochety ve tkáních
se nerozmnožují, kvůli dělení cestují do krve. Proto se při reaktivaci infekce vytvoří znovu IgM - imunitní systém si nového přírůstku v krvi samozřejmě všimne a vidí to jako novou nákazu. Po celou dobu ale zůstává IgG. Proč se množí jen v krvi, to se přesně neví, ale může to být i tím, že erytrocyty obsahují velké množství zinku. Zinek borelie k množení potřebují, pro stavbu metaloproteáz nutných k buněčnému dělení. Dokážou využít jen zinek ve formě fosfátu zinečnatého, chloridy nechávají být. Železo skutečně nepotřebují a nevyužívají, narozdíl od většiny ostatních bakterií. Dr. Hulínská to prokázala vlastním výzkumem, který prováděla společně s manželem pomocí transmisního el. mikroskopu s jednotkou EDAX (rentgenová analýza prvků). Pracovali nezávisle na podobném výzkumu prof. Sieverse, jehož práci nezná, předali jsme tedy na něj kontakt.

Cysty
borelie v nepříznivých podmínkách dokáže vylučovat tisíce váčků, obalit se jimi a vytvořit na svém povrchu biofilm. Poté váčky uvolní do okolního prostředí a zbaví se buněčné stěny, sbalí se do kulovitého tvaru pokrytého jen cytoplazmatickou membránou - podobnou jako mají lidské buňky. Na povrchu zůstávají patrné antigeny OspA a někdy také flagelin (p41). Tento děj může proběhnout velmi rychle, ve vteřinách, nebo trvat několik hodin. Cysta se nemnoží, ale dozajista nějaké metabolické děje v ní probíhají, něco přijímá a do okolí něco vylučuje - co přesně, to se neví. Uvolňované váčky neboli vesikly, "blebs" mají velikost v nanometrech a nikdo netuší, co vlastně tyto nanočástice obsahující plasmidovou DNA a dokážou v lidském těle natropit, a obecně před nanotechnologiemi a jejich nevyzpytatelným působením v těle člověka varuje... Práci bratří Brorsonů dr. Hulínská zná, i mikrobiologa Oysteina Brorsona osobně, přesto není přesvědčena o účinnosti metronidazolu in vivo na cystickou formu. Není zatím zcela jistě známo, jestli vůbec lze vůbec cysty v lidském těle zabít...

Zkoumáním citlivosti borelií na jednotlivá atb se momentálně nikdo v ČR nezabývá, dříve na tom pracovala doc. Janovská, která také zjistila, že jeden ze sedmi výše uvedených kmenů B. garinii je přirozeně rezistentní na penicilin.

Z jednoho klíštěte se můžete nakazit většinou jedním druhem borelií, vzácně dvěma (afzelii+ burgdorferi s.s.), protože garinii přenášejí výhradně ptáci, a ti mají vyšší tělesnou teplotu, ostatním boreliím se v nich nedaří. B. garinii je tudíž výjimkou, která má raději kultivační teploty kolem 37°C, ostatní se pak kultivují při té obvykle uváděné teplotě 33 - 35°C. V serologických testech nelze brát vůbec vážně uváděné jednotlivé druhy borelií, i když testy prováděné zvlášť na B. afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto jsou citlivější, tak skutečně přesně určit o který druh, případně i kmen v rámci druhu (viz výše 7 kmenů B. garinii a jejich rozdílná citlivost na atb) lze jedině sekvenováním genetického kódu metodou PCR.

Testy na CD57+ NK buňky jako diagnostický nástroj:
dle dr. Hulínské určitě nějakou roli v infekci hrají. Pro srovnání uvedla skutečnost, že ehrlichie využívají povrchové molekuly leukocytů pro to, aby do nich mohly, konkrétně u neutrofilů CD15+ a monocytů CD14+. Bez součinnosti těchto molekul při průniku ehrlichie do buňky se nákaza neuchytí. Pro borelie a CD57+ NK buňky bude zřejmě platit nějaký podobný vztah... ovšem o patogenezi boreliozy je dosud známo velmi málo, a z vyšších míst není zájem na tom, aby se to změnilo. Laboratoř bojuje o finance, jsou v ní rušena pracovní místa bez náhrady, pracoviště se světovou úrovní výzkumu je na okraji zájmu zřizovatele - tj. Ministerstva zdravotnictví. Přislíbili jsme, že se budeme ze všech sil zasazovat o změnu této situace.

Naprosto bez zájmu a bez dalšího zkoumání je například ponechaná zajímavá skutečnost, že v ještěrkách a hadech byly nalezeny neživotaschopné cysty borelií. Pokud se klíště nakažené živými spirochetami přisaje na ještěrku (což se normálně stává, klíšťata jak vidět obtěžují snad všechny živočišné druhy:-(, tak ještěrčí krev spirochety zabije. Dá se jen spekulovat, zda je to dané dlouhým soužitím klíšťat, borelií a ještěrů ještě za časů, kdy tu teplokrevní živočichové nebyli.. a jestli/jak by se to dalo využít prakticky, to bohužel nikoho nezajímá, takový výzkum nikdo financovat nebude:-(

Pokud jde přímo o činnost laboratoře i testování obecně:
Ročně vyšetřují v pěti lidech tisíce vzorků, vše archivují – zahlédli jsme velice pečlivě vedenou dokumentaci ke každému pacientovi, od žádanky přes veškerá provedená vyšetření, fotografie z elektronového mikroskopu, nákresy, poznámky...

Jako jediná laboratoř v ČR borelie i kultivují, rozpoznávají jednotlivé kmeny, a připravují si vlastní materiál pro serologické testování. Materiál pochází z borelií, které skutečně žily a to i delší dobu v lidech, v pacientech - proto budou tyto testy vždy přesnější.

Komerční laboratoře používají sety od velkovýrobců zhotovené z borelií extrahovaných z klíšťat, a ty mají jinou antigenní výbavu než borelie v lidech. Komerční westernbloty se vyrábějí dokonce tak, že se některé antigeny vyrobí uměle, např. "vyříznou" z bakterie E. coli OspC antigen, zmnoží ho a nanesou na proužek. Tento cizorodý a zesílený antigen v IgM pak může falešně pozitivně reagovat dokonce s IgG protilátkou. Samotný pozitivní OspC v IgM tedy považuje za chybu laboratoře, obzvlášť když je to jediný antigen z celé serologie - pak se může jednat o falešně pozitivní test, přestože tento specifický antigen je pozitivní. Naopak třeba i samostatně pozitivní p83 v IgM je zaručená reaktivace chronické infekce...

V minulosti byl na laboratoř činěn nátlak, aby své výzkumy dala k dispozici komerčním výrobcům, kteří by ji pak dobře zpeněžili - tomu se ubránili. Každoročně provádějí celorepublikové vyhodnocování vyšetření slepých vzorků pro porovnání kvality práce komerčních laboratoří. Na akreditační řízení však nemají žádný vliv, licence nepřidělují ani nemohou odebírat. Z komerčních laboratoří dříve spolupracovali s Cytolabem a jeho sety tedy bylo možné považovat za kvalitní a spolehlivé. Po zániku Cytolabu je převzala laboratoř Aeskulab na Barrandově (pokusíme se zjistit víc info)
Poté spolupracovali také s firmou TestLine Brno, kde nyní používají materiál pro výrobu testů Elisa ze SZÚ, z Western blotu pouze sety na B. garinii, ale afzelii a burgorferi s.s. již tak spolehlivé být nemusí, ty mají odjinud.

Elisa - jako screeningový test (tj. prováděný jako první a "vyřazovací") se používá z prostého důvodu - je velmi časově i materiálově nenáročný, během několika minut lze zpracovat 80 vzorků! Kdyby se všem pacientům s podezřením na boreliózu dělal ihned WB test, laboratoře by to kapacitně vůbec nezvládly. Elisa má ovšem citlivost asi 50-60%, tudíž polovina pacientů opravdu propadne sítem a jsou poddiagnostikováni. Pozitivní Elisa by tedy měla být důvodem k dalšímu důkladnému vyšetření, negativní výsledek bohužel nemá žádný význam. U Elisy v IgM zkříženě reagující revmatoidní faktor by se dal ze vzorků napřed vyseparovat - je to ale velmi časově náročné, proto se to nedělá.

Vyšetření synoviální tekutiny
Při otoku kloubu s výpotkem se jedná s vekou pravděpodobností o boreliozu. Asi 70% výpotků nacházejí PCR pozitivních, z tekutiny se však nikdy nepodařilo vykultivovat borelie. Žijí totiž přímo v synoviální membráně, která tekutinu produkuje - což bylo minimálně v jednom případě prokázáno. Lymská artritida tedy není žádná autoimunita - protilátky proti OspA jsou skutečné protilátky proti živým boreliím v kloubu, zřejmě cystám pokrytým OspA antigenem.

Na závěr jsme se s Dr. Hulínskou předběžně dohodli, že takhle návštěva nebude poslední a zdá se, že by určitou formu spolupráce i stála. Doporučovala obrátit se v další fázi na doc. Bojara, eventuelně i prof. Bartůňka a prof. Hercogovou a tlačit na zdr. pojišťovny a MZ. Na některé dotazy bohužel nevyšel čas, ale pevně věříme že v budoucnu budou ještě příležitosti zvídavé otázky nás laiků položit.

16. 7. 2010 Petr, Radka